熒光定量PCR的原理、方法及結果分析

　　熒光定量PCR的原理、方法及結果分析
　　自K. Mullis發明聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR技術很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。RT-PCR（實時熒光定量PCR技術）就是在PCR的基礎上加入熒光基團，通過熒光信號的變化的實時監測PCR的反應過程，通過對未知模板進行定量分析的方法。目前，實時熒光定量 PCR 已成為不同樣品間進行基因表達水平定量差異比較的權威性方法。在過去十幾年中，該方法迅速流行，涉及科學的多個領域，包括農業、環境、工業和醫學研究。
　　目前，qPCR技術已經廣泛應用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉基因食品檢測、動物疫病檢測等，除此之外，還包括：
　　● 基因擴增
　　● 擴增特異性分析
　　● 基因定量分析
　　● 基因檢測
　　● 基因分型
　　● SNP分析
　　● RFLP多態性分析
　　● 單/多基因表達研究
　　● 高通量基因表達譜研究
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　　（1）染料法
　　熒光染料可與雙鏈DNA結合，每個循環的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。同時，其缺點也在于其非特異性。當PCR反應中有引物二聚體或者非特異性擴增時，該染料也可以和這些非特異性擴增產物結合，發出熒光，從而干擾對特異性產物的準確定量。
　　常用的染料為SYBR Green I，各公司針對熒光信號強度、抑制作用等進行改進，也推出了很多新的染料供大家選擇。
　　Promega采用新型熒光染料BRYT Green? Dye，對qPCR反應沒有抑制作用，與雙鏈DNA結合后熒光信號更強.
　?。?）探針法
　　在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標記一個報告熒光基團，3’端標記一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。
　?。?）熒光定量
　　一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化;在平臺期，擴增產物已不再呈指數級增加，PCR終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，無法計算起始模板拷貝數。因此只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了幾個重要的概念：擴增曲線、熒光閾值、CT值。
　　注：
　　橫坐標：代表擴增循環數;
　　縱坐標：代表熒光強度，每個循環進行一次熒光信號收集。
　　熒光閾值(Threshold)
　　在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設置是PCR反應前3-15個循環熒光信號標準偏差的10倍。(如下圖)
　　每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。同時，對于熒光PCR實驗來說，CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標。(如下圖)
　　實驗室應用
　　PCR檢測方法在臨床醫學及實驗室檢驗中最有價值的應用領域就是對感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR方法就可以檢測到。該方法對病原體的檢測解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，常用于疾病的早期診斷，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態。
　　大量的熒光定量PCR研究資料表明，病原體數量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關性。因此，通過熒光定量PCR方法得到的檢測結果，一定程度上可以準確反映疾病感染的情況。
　　除此之外，也可以見于腫瘤分子機制、遺傳病篩查、樣本成分鑒定等多方面的實際應用中。